微晶電子衍射（MicroED）技術(shù)作為近年來發(fā)展快速的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)，結(jié)合了冷凍電鏡的高分辨率成像與電子衍射的高靈敏度分析，可直接用于確定結(jié)晶樣品微小顆粒的晶體結(jié)構(gòu)、測(cè)定混合物組分結(jié)構(gòu)、判斷絕對(duì)構(gòu)型以及氫鍵轉(zhuǎn)移判定等場(chǎng)景。

相較于傳統(tǒng)方法，MicroED 能夠單次對(duì)大批量微粒進(jìn)行分析，可在短時(shí)間內(nèi)就能收集到大量的衍射數(shù)據(jù)，還可以對(duì)單個(gè)微粒進(jìn)行衍射分析，進(jìn)行微量雜質(zhì)的檢測(cè)。近年來，MicroED 技術(shù)在晶型藥物研發(fā)及新材料的開發(fā)等領(lǐng)域已有較為廣泛的應(yīng)用，無論是學(xué)術(shù)界還是產(chǎn)業(yè)界，大家對(duì)這一新技術(shù)的了解都在日漸加深。

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案例分享 | MicroED在藥物早期研發(fā)階段的應(yīng)用解析

基于 MicroED 的技術(shù)特點(diǎn)，晶泰科技結(jié)構(gòu)測(cè)定團(tuán)隊(duì)跳出其主要在晶型藥物上應(yīng)用的限制，創(chuàng)新性地將該技術(shù)應(yīng)用于無定形固體分散體（Amorphous Solid Dispersion, ASD）的穩(wěn)定性評(píng)估領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)微量結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)識(shí)別。本文通過實(shí)際案例解析該技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用。

技術(shù)痛點(diǎn)：ASD體系微量結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)解析挑戰(zhàn)

某創(chuàng)新藥研發(fā)案例中，客戶采用 ASD 技術(shù)提升難溶藥物的生物利用度，卻在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)（3 個(gè)月/40℃/75%RH）中發(fā)現(xiàn)異常現(xiàn)象，穩(wěn)定性樣品的 XRPD 譜圖中檢測(cè)到微弱衍射峰（2θ=3°-20°區(qū)間，如圖 1 所示），本項(xiàng)目需要快速明確 ASD 體系中結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)，以便能快速重新進(jìn)行 ASD 配方研究，避免對(duì)后期研發(fā)造成較大影響。

常規(guī) XRPD 定量分析檢測(cè)限通常為 2% w/w，無法實(shí)現(xiàn)低含量結(jié)晶相的分析；傳統(tǒng)的單晶培養(yǎng)則需耗時(shí)長(zhǎng)達(dá) 2-8 周，并且微量晶體難以分離提純，無法用于 ASD 體系微量結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)的快速分析。

因此急需尋找一種創(chuàng)新方法快速獲取微量結(jié)晶組分的晶體結(jié)構(gòu)。

技術(shù)破局：MicroED應(yīng)用于ASD系統(tǒng)中結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)解析領(lǐng)域

晶泰科技研發(fā)人員對(duì)目標(biāo) ASD 體系譜圖進(jìn)行初步分析后，確認(rèn) XRPD 譜圖中的衍射峰強(qiáng)度過弱，無法利用常規(guī) XRPD 來分析確認(rèn)結(jié)晶組分的種類，只能通過直接檢測(cè)樣品中的微量結(jié)晶態(tài)粒子來確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。

相比于 XRPD 技術(shù)，MicroED 采用高能電子束，可以在納米級(jí)晶體顆粒上產(chǎn)生足夠強(qiáng)的衍射信號(hào)。這樣一來，非常少量微小尺度（~100 nm）的結(jié)晶度較高的晶粒就足以產(chǎn)生高分辨率的電子衍射圖案供晶體結(jié)構(gòu)解析，大大降低了對(duì)晶體樣品在形狀、尺寸、純度方面的要求。

由于可以直接使用粉末樣品、避免了耗時(shí)漫長(zhǎng)的培養(yǎng)單晶的過程，MicroED 相比于 SCXRD 可以顯著縮短晶體結(jié)構(gòu)解析的項(xiàng)目周期，還可以高通量進(jìn)行大量顆粒的衍射數(shù)據(jù)收集，因此研發(fā)人員選擇使用 MicroED 技術(shù)來分析目標(biāo) ASD 體系中的微量結(jié)晶組分種類。

項(xiàng)目流程：

晶泰科技研發(fā)人員利用 MicroED 的自動(dòng)數(shù)據(jù)收集裝置，在較短的時(shí)間內(nèi)掃描并收集目標(biāo) ASD 體系大量微粒衍射數(shù)據(jù)，并從中進(jìn)行無定形微粒和結(jié)晶態(tài)微粒的篩選。無定形微粒的衍射圖譜中不會(huì)出現(xiàn)衍射信號(hào)，而結(jié)晶態(tài)微粒的衍射圖譜中會(huì)出現(xiàn)較為明顯的衍射信號(hào)，如下圖所示：

晶泰科技結(jié)構(gòu)解析團(tuán)隊(duì)在 1 周的時(shí)間內(nèi)收集并分析了 1000 多個(gè)微粒的衍射信號(hào)。通過解析出 1000 個(gè)微粒中含有的不同晶型，確定樣品中存在 0.3% w/w 的 API Form II 晶體。

MicroED構(gòu)建ASD穩(wěn)定性研究新方法

在 ASD 穩(wěn)定性研究中，穩(wěn)定性樣品的 XRPD 譜圖中發(fā)現(xiàn)不確定的衍射峰，需要快速確認(rèn)體系內(nèi)是否存在結(jié)晶組分，并確認(rèn)其晶體結(jié)構(gòu)。在這一場(chǎng)景下，MicroED 技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

? 快速判斷 ASD 體系中是否含有結(jié)晶組分：由于 MicroED 可以單次對(duì)大批量微粒進(jìn)行分析，短時(shí)間收集大量衍射數(shù)據(jù)，因此能根據(jù)樣品中是否存在衍射現(xiàn)象，來快速判斷 ASD 樣品是否有結(jié)晶傾向。

? 快速解析微量結(jié)晶組分結(jié)構(gòu)：常規(guī) XRPD 定量限無法實(shí)現(xiàn)低含量結(jié)晶相的分析，同時(shí)傳統(tǒng)單晶培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)且微量晶體難以分離提純，MicroED 作為一項(xiàng)可直接觀察和分析微小顆粒晶體結(jié)構(gòu)的創(chuàng)新技術(shù)，能夠快速篩選無定形粒子和結(jié)晶態(tài)粒子，較短時(shí)間內(nèi)快速確證 ASD 體系中的微量晶體結(jié)構(gòu)。

未來展望 

隨著 MicroED 技術(shù)的不斷成熟和普及，其在 ASD 穩(wěn)定性評(píng)估領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加廣闊。未來，我們期待看到更多基于 MicroED 的創(chuàng)新方法被開發(fā)出來，如結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法進(jìn)行自動(dòng)化分析，進(jìn)一步提升評(píng)估的準(zhǔn)確性和效率。

總之，MicroED 技術(shù)的引入，為固體分散體的穩(wěn)定性評(píng)估帶來了新的手段，它不僅提高了評(píng)估的精度和效率，更為制藥行業(yè)的創(chuàng)新與發(fā)展注入了新的活力。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和應(yīng)用實(shí)踐的深入，我們有理由相信 MicroED 將會(huì)在保障藥物質(zhì)量方面發(fā)揮越來越重要的作用。

晶泰科技的 MicroED 晶體結(jié)構(gòu)解析平臺(tái), 配置 200kV 冷凍透射電子顯微鏡，無需單晶培養(yǎng)，僅需要少量（mg）結(jié)晶粉末樣品，最快可在 1 天內(nèi)完成高精度的晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定，至今已成功完成 400 多個(gè)小分子藥物的晶體結(jié)構(gòu)解析。歡迎點(diǎn)擊下方鏈接進(jìn)行業(yè)務(wù)咨詢。

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瑞德西韋 (Remdesivir) 有兩個(gè)性質(zhì)接近的無水晶型，哪個(gè)晶型更穩(wěn)定在此前研究條件下尚不清楚，本案例的目標(biāo)是對(duì)瑞德西韋兩個(gè)無水晶型的相對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究，并且確認(rèn)不同溫度下的最穩(wěn)定晶型。

在33天內(nèi)快速確認(rèn) Form II 在室溫和高溫下均為最穩(wěn)定晶型：

• MicroED解析出 Form II 和 Form IV 的晶體結(jié)構(gòu), 同時(shí) Form IV結(jié)構(gòu)首次解析得到。
• CSP結(jié)果證實(shí)室溫下 Form II 比 Form IV 更為穩(wěn)定, 而二者在室溫下的穩(wěn)定性較為接近。
• 通過CSP計(jì)算，在33天內(nèi)快速確認(rèn)瑞德西韋 Form II 為優(yōu)選晶型，效率是常規(guī)晶型研究（~60 天）的兩倍 。

本案例表明CSP技術(shù)是加速晶型決策，降低后期轉(zhuǎn)晶風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。

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目標(biāo)化合物中API與甲磺酸的理論化學(xué)計(jì)量比為1:1，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)際比例約為1:1.6，且不同批次樣品存在波動(dòng)（1:1.55~1:65），確定該目標(biāo)化合物中API與配體甲磺酸的比例具有一定的挑戰(zhàn)性。

MicroED技術(shù)助力內(nèi)含無序分子及化學(xué)計(jì)量比可變復(fù)雜體系的結(jié)構(gòu)解析：

• 通過MicroED解析粉末樣品晶體結(jié)構(gòu)，揭示了甲磺酸分子在晶格通道中無序排列狀態(tài)。
• 晶體中配體分子的數(shù)量可能是可變的，導(dǎo)致不同樣品批次之間存在不同的化學(xué)計(jì)量比。
• 該案例展示了MicroED在晶體結(jié)構(gòu)解析方面（尤其是針對(duì)難培養(yǎng)單晶體系）的強(qiáng)大能力。

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目標(biāo)化合物兩個(gè)批次樣品（樣品1和樣品2）的XRPD譜圖極其相似，兩個(gè)樣品的表征數(shù)據(jù)具有顯著差異：TGA結(jié)果顯示兩個(gè)樣品在100°C之前分別出現(xiàn) 1.5% 和 3% 的失重，由于樣品的晶體結(jié)構(gòu)未知，無法確認(rèn)樣品1和樣品2是否為同一晶型。

  MicroED技術(shù)可用于區(qū)分結(jié)構(gòu)高度相似的不同晶型，降低產(chǎn)品中存在混合晶型的風(fēng)險(xiǎn)：

• MicroED結(jié)果解釋了樣品1和樣品2雖然具有相似XRPD光譜，但具有完全不同的晶體結(jié)構(gòu)。
• 如果沒有發(fā)現(xiàn)這兩種結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致最終樣品中含有混合晶型，進(jìn)而影響理化性質(zhì)與質(zhì)量管控。
• 案例結(jié)果表明，在僅有粉末晶體樣品時(shí)，MicroED是快速且有效判定多晶型晶體結(jié)構(gòu)的有利方法。

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